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新一代免洗光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)-多重發(fā)光氧通道免疫檢測（Multi-LOCI）


      光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)——一種新型的第四代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，由于其是一種均相的反應(yīng)平臺，在檢測過程中無需分離系統(tǒng)，具有免洗、背景低，靈敏度高，重復(fù)性好且操作簡單耗時短的優(yōu)點，已經(jīng)受到越來越多IVD企業(yè)的關(guān)注。光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)又稱發(fā)光氧通道免疫分析（Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI）技術(shù)，在1994由Ullman EF等人提出，后由德靈診斷開發(fā)為商業(yè)化產(chǎn)品 [具體原理介紹可見上一篇推送：發(fā)光氧通道免疫分析技術(shù)（LOCI）]。近年來，LOCI技術(shù)市場規(guī)模保持快速增長，但是占整個化學(xué)發(fā)光市場比例很小，增長空間巨大。光激化學(xué)發(fā)光的技術(shù)壁壘較高，目前涉足的企業(yè)很少。

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LOCI原理示意圖[1]



西門子：2007年11月，西門子收購德靈公司，從而擁有LOCI技術(shù)，并將其應(yīng)用于全自動生化免疫一體機系列產(chǎn)品（Dimension?系列）。Dimension系列可通過LOCI技術(shù)檢測如甲狀腺激素、腫瘤標(biāo)志物、骨代謝標(biāo)志物等20項項目。
珀金埃爾默：珀金埃爾默診斷（PerkinElmer）其AlphaLISA業(yè)務(wù)主要在于銷售微球原材料，以及為科學(xué)研究領(lǐng)域提供技術(shù)方案。此外，PerkinElmer發(fā)展了AlphaPlexTM的多重檢測平臺[2]，利用在受體球（ABs）內(nèi)摻雜不同發(fā)射波長（615 nm、545 nm、645 nm）的鑭系金屬配合物用于檢測不同的待測分子，實現(xiàn)多重檢測。然而稀土元素的種類有限，目前PerkinElmer只開發(fā)了3重受體微球。
科美診斷：科美診斷是國內(nèi)最早推出光激化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑和儀器產(chǎn)品的企業(yè)，幾乎代表了國內(nèi)所有的光激化學(xué)發(fā)光細(xì)分市場份額。公司產(chǎn)品基于光激化學(xué)發(fā)光法的 LiCA 系列診斷試劑主要應(yīng)用于傳染?。ㄈ缫腋?、丙肝、艾滋病、梅毒、甲肝、戊肝等）標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物、甲狀腺激素、生殖內(nèi)分泌激素、心肌標(biāo)志物及炎癥等的檢測。
成都愛興：愛興生物首創(chuàng)將均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)用于POCT。公司目前產(chǎn)品覆蓋心臟標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物、胃功能、腎功能等領(lǐng)域。


多重發(fā)光氧通道免疫檢測（Multi-LOCI）


雖然光激化學(xué)發(fā)光在免疫診斷中具有諸多優(yōu)勢，但是無法實現(xiàn)多聯(lián)檢是其重要的技術(shù)瓶頸。近期上海交通大學(xué)團隊將編碼微球技術(shù)和LOCI技術(shù)結(jié)合，發(fā)展了一種新型的免洗式的多重檢測技術(shù)-多重發(fā)光氧通道免疫分析（Multiplexed luminescent oxygen channeling immunoassay, multi-LOCI）技術(shù)[3-4]。相關(guān)成果已發(fā)表在國際領(lǐng)域權(quán)威雜志《Small》和《ASC omega》上，并申請/授權(quán)多項專利。



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Multi-LOCI技術(shù)所使用的復(fù)合微球包含兩個模塊：
（1）提供編碼信號的主體的編碼微球，可用于識別多種分析物；
（2）能夠提供用于定量檢測特定待測物LOCI信號的受體球（ABs）。


Multi-LOCI原理如下圖所示，與AlphaLISA類似，當(dāng)加入目標(biāo)分析物后，multi-LOCI微球上的捕獲抗體將會和待測分子以及檢測抗體形成免疫夾心復(fù)合物，之后偶聯(lián)鏈霉親和素的供體微球（DB-SA）通過鏈霉親和素和生物素的特異性結(jié)合作用被標(biāo)記在微球上。使用680 nm激光激發(fā)出ABs波長為615 nm的檢測熒光信號，即LOCI信號。通過統(tǒng)計熒光圖像中微球上的雙色熒光信號，以判斷檢測目標(biāo)物分子的種類和濃度。進而通過編碼微球的熒光信號定位微球的LOCI檢測信號，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測待測目標(biāo)物。與Luminex公司的xMAP編碼微球技術(shù)相比，multi-LOCI不僅僅具有多重的檢測能力，同時其反應(yīng)操作步驟簡單，只需兩步反應(yīng)，無需進行繁瑣的反復(fù)洗滌，便可實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、多重的檢測。

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Multi-LOCI原理示意圖[4]

下表對比了LOCI、multi-LOCI、Luminex技術(shù)現(xiàn)狀。

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多重發(fā)光氧通道免疫檢測的應(yīng)用

       我們評估了multi-LOCI技術(shù)在檢測PCT標(biāo)準(zhǔn)品的檢測性能，以及PCT臨床樣本的檢測性能，同時評估了PCT/IL-6聯(lián)檢（IP組合）的性能。

PCT單指標(biāo)的檢測性能

       PCT指標(biāo)重組抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線以及臨床樣本檢測性能的數(shù)據(jù)，可以看到multi-LOI技術(shù)檢測靈敏度高，PCT指標(biāo)標(biāo)曲計算的得到的檢測限為6.39 pg/mL，檢測線性范圍約5個數(shù)量級。使用9例血清樣本檢測PCT項目，結(jié)果顯示multi-LOCI技術(shù)可以準(zhǔn)確定量臨床樣本，與羅氏cobas電化學(xué)發(fā)光平臺相比具有出色的相關(guān)性。

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      選取接近線性下限、低、高濃度校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)品進行測試，測試10次，結(jié)果表明10次測試結(jié)果一致，測試結(jié)果CV較小，multi-LOCI技術(shù)的精密度好。

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PCT/IL-6項目組合的檢測性能

      PCT/IL-6雙指標(biāo)重組抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，PCT/IL-6聯(lián)檢沒有表現(xiàn)出交叉反應(yīng)，且PCT和IL-6指標(biāo)的檢測靈敏度分別為6.28 pg/mL以及2.15 pg/mL，檢測性能好，檢測線性范圍約5個數(shù)量級。

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Multi-LOCI在POCT多聯(lián)檢應(yīng)用中的展望

       此外，Multi-LOCI懸具有快速、便捷、低成本、高靈敏的特點。結(jié)合小型化成像設(shè)備，以及微流控芯片/單人份試劑卡槽等裝置，可形成一套基于POCT的多聯(lián)檢系統(tǒng)（如下圖），有望解決目前的POCT產(chǎn)品性能低、無法實現(xiàn)高性能且中大panel多聯(lián)檢的問題。

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     綜上所述，Multi-LOCI是新一代的免洗多重檢測技術(shù)，其反應(yīng)操作步驟簡單，無需繁瑣的洗滌，便可實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、多重的檢測。一方面可作為中心實驗室高通量、多聯(lián)檢方案，另一方面可進一步發(fā)揮其方便快捷、設(shè)備簡單的優(yōu)勢，形成POCT多聯(lián)檢系統(tǒng)。針對以上兩個方面的應(yīng)用場景，羧菲生物可為終端合作企業(yè)提供一體化、私人訂制的multi-LOCI原材料和應(yīng)用解決方案，同時也提供科研檢測服務(wù)。歡迎有需求的企業(yè)和個人聯(lián)系羧菲。

 

[1] Beaudet L., Rodriguez-Suarez R., Venne M.-H., et al. AlphaLISA immunoassays: The no-wash alternative to ELISAs for research and drug discovery [J]. Nature Methods, 2008, 5(12): an8-an9.

[2] Roby P., Bosse R., Arcand M. et al. Multiplex assay methods and compositions [P]. EP: EP2398868, 2011-12-28.

[3] Guo, Q., Wang, Y., Chen, C., et.al., Multiplexed Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay Based on Dual-Functional Barcodes with a Host–Guest Structure: A Facile and Robust Suspension Array Platform. Small 2020, 16, 1907521. https://doi.org/10.1002/smll.201907521.

[4] Zuying Feng, Qingsheng Guo*, Yao Wang, et.al., Evolution of “On-Barcode” Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay by Exploring the Barcode Structure and the Assay System. ACS Omega 2022, 7, 2, 2344–2355. DOI:10.1021/acsomega.1c06236.