發(fā)光氧通道免疫分析（Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay, 以下簡(jiǎn)稱「LOCI 分析技術(shù)」）是一種均相免疫分析技術(shù)。LOCI 技術(shù)最早由德靈診斷（Behring Diagnosis Inc.）的 Edwin F. Ullman 等學(xué)者提出并開發(fā)，相關(guān)研究成果發(fā)表在 PNAS1 及 Clinical Chemistry2 等期刊上。
LOCI 分析技術(shù)的工作原理
LOCI 分析技術(shù)主要依托「受體微球」與「供體微球」兩種聚合物納米微球?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)。如圖 1 所示，檢測(cè)體系中存在待測(cè)物時(shí)，兩種微球表面修飾的抗體與待測(cè)物發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。經(jīng)激發(fā)光照射檢測(cè)體系，復(fù)合物中的供體微球產(chǎn)生的單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微球，受體微球中的化學(xué)發(fā)光試劑捕獲單線態(tài)氧后產(chǎn)生光信號(hào)。由于單線態(tài)氧活性高、半衰期短，只有當(dāng)供體微球和受體微球距離足夠接近（形成免疫復(fù)合物）的情況下，供體微球釋放的單線態(tài)氧才能有效地到達(dá)受體微球，從而產(chǎn)生一系列化學(xué)反應(yīng)，發(fā)射出反斯托克斯光信號(hào)。當(dāng)體系中不存在待測(cè)物時(shí)，即不形成免疫復(fù)合物，游離供體微球產(chǎn)生的單線態(tài)氧快速在體系中耗散，幾乎不產(chǎn)生 LOCI 信號(hào)。以上就是 LOCI 分析技術(shù)的簡(jiǎn)要工作原理。
圖 1 LOCI 檢測(cè)示意圖
LOCI 分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
1.均相免洗
不同于目前市場(chǎng)上主流的非均相免疫分析技術(shù)，LOCI 檢測(cè)反應(yīng)為均相反應(yīng)模式且游離的標(biāo)記物不產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。因此，不需要多次洗滌去除游離的標(biāo)記物，反應(yīng)過程無需清洗和分離，只需檢測(cè)試劑與待檢測(cè)樣本充分反應(yīng)后，使用光激發(fā)，測(cè)定光信號(hào)的強(qiáng)度即可完成檢測(cè)。因此，LOCI 分析技術(shù)大大縮短了檢測(cè)流程及檢測(cè)時(shí)間。
2.抗干擾
發(fā)光檢測(cè)技術(shù)中，消除背景熒光的干擾對(duì)于提高檢測(cè)靈敏度、重現(xiàn)性等具有重要意義。LOCI 分析技術(shù)利用單線態(tài)氧介導(dǎo)的能量傳遞過程，實(shí)現(xiàn)了「長(zhǎng)波激發(fā)-短波發(fā)射」的反斯托克斯發(fā)光，幾乎完全消除了基質(zhì)中背景熒光物質(zhì)對(duì)檢測(cè)分析的干擾，從而大大提高了 LOCI 分析技術(shù)的檢測(cè)性能。同時(shí)，LOCI 分析中的光信號(hào)還具有長(zhǎng)壽命發(fā)光的特點(diǎn)，可以利用時(shí)間分辨或時(shí)間門技術(shù)進(jìn)一步消除背景信號(hào)的干擾。
LOCI 技術(shù)的前沿應(yīng)用
1.細(xì)胞外囊泡分析
自 2013 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國科學(xué)家詹姆斯·羅思曼、蘭迪·謝克曼以及德國科學(xué)家托馬斯·祖德霍夫以來，細(xì)胞外囊泡作為一類重要的疾病標(biāo)志物，持續(xù)受到關(guān)注。而細(xì)胞外囊泡的分離純化一直是分析過程中的重大挑戰(zhàn)，為了克服這一挑戰(zhàn)，Takahiro Ochiya 等學(xué)者利用 LOCI 技術(shù)構(gòu)建了一種免純化的細(xì)胞外囊泡分析方法（圖 2）。3 通過在供體微球和受體微球表面修飾特定抗體，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞外囊泡存在時(shí)即會(huì)形成可有效進(jìn)行單線態(tài)氧傳輸?shù)拿庖邚?fù)合物，不需要復(fù)雜而冗長(zhǎng)的純化過程，即能產(chǎn)生 LOCI 信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)。
圖 2 LOCI 技術(shù)用于細(xì)胞外囊泡分析3
2.微流控芯片
均相免洗是 LOCI 技術(shù)的一大特色，應(yīng)用 LOCI 技術(shù)可以極大地簡(jiǎn)化微流控芯片的設(shè)計(jì)，降低其制備成本。在 Katsuo Kurabayashi 等學(xué)者發(fā)表的研究中，通過將 LOCI 技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，簡(jiǎn)化了微流控芯片的結(jié)構(gòu)和檢測(cè)流程，實(shí)現(xiàn)了一種可批量制造、可大規(guī)模生產(chǎn)且堅(jiān)固耐用的免疫分析微流控裝置。4 Jianping Fu 等學(xué)者則是在微流控芯片上構(gòu)筑了用于高通量 LOCI 檢測(cè)的裝置，實(shí)現(xiàn)了 45 分鐘內(nèi)在單個(gè)芯片上同時(shí)完成 8 個(gè)樣本的檢測(cè)需求，檢測(cè)限低至 10pg mL-1。5
綜上所述，作為一種新型的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，LOCI 分析技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)（如 ELISA、流式分析等）具有均相免洗、高靈敏、操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化等諸多優(yōu)勢(shì)。其在國內(nèi)的受關(guān)注度也持續(xù)提高，國內(nèi)已有多家知名廠商在積極布局 LOCI 相關(guān)原材料、儀器的研發(fā)，相信這會(huì)是一項(xiàng)改變未來免疫檢測(cè)市場(chǎng)格局的革命性技術(shù)。
1. Ullman, E. F.; Kirakossian, H.; Singh, S.; Wu, Z. P.; Irvin, B. R.; Pease, J. S.; Switchenko, A. C.; Irvine, J. D.; Dafforn, A.; Skold, C. N.; et al., Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91 (12), 5426-5430.
2. Ullman, E. F.; Kirakossian, H.; Switchenko, A. C.; Ishkanian, J.; Ericson, M.; Wartchow, C. A.; Pirio, M.; Pease, J.; Irvin, B. R.; Singh, S.; Singh, R.; Patel, R.; Dafforn, A.; Davalian, D.; Skold, C.; Kurn, N.; Wagner, D. B., Luminescent oxygen channeling assay (LOCI): sensitive, broadly applicable homogeneous immunoassay method. Clin. Chem. 1996, 42 (9), 1518-1526.
3. Yoshioka, Y.; Kosaka, N.; Konishi, Y.; Ohta, H.; Okamoto, H.; Sonoda, H.; Nonaka, R.; Yamamoto, H.; Ishii, H.; Mori, M.; Furuta, K.; Nakajima, T.; Hayashi, H.; Sugisaki, H.; Higashimoto, H.; Kato, T.; Takeshita, F.; Ochiya, T., Ultra-sensitive liquid biopsy of circulating extracellular vesicles using ExoScreen. Nat. Commun. 2014, 5, 3591.
4. Stephens, A.; Nidetz, R.; Mesyngier, N.; Chung, M. T.; Song, Y.; Fu, J.; Kurabayashi, K., Mass-producible microporous silicon membranes for specific leukocyte subset isolation, immunophenotyping, and personalized immunomodulatory drug screening in vitro. Lab Chip 2019, 19 (18), 3065-3076.
5. Yu, Z. T.; Guan, H.; Cheung, M. K.; McHugh, W. M.; Cornell, T. T.; Shanley, T. P.; Kurabayashi, K.; Fu, J., Rapid, automated, parallel quantitative immunoassays using highly integrated microfluidics and AlphaLISA. Sci. Rep. 2015, 5, 11339.
本文作者
沈斌 博士
上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司