1.前言
在之前的文章中（超高通量懸浮芯片新策略）我們介紹了一種編碼微球懸浮芯片技術(shù)的編碼策略，該策略制備了 300 種不同編碼元素組合的編碼微球，配合流式細(xì)胞儀解碼可以實(shí)現(xiàn)這 300 重編碼微球的準(zhǔn)確解碼 [1]。本期我們從解碼的角度來(lái)聊一聊懸浮芯片的新型解碼策略——成像解碼。
懸浮芯片編碼微球的準(zhǔn)確解碼是其實(shí)現(xiàn)多重定量檢測(cè)的關(guān)鍵。解碼過(guò)程一方面涉及微球本身編碼信號(hào)的讀取，另一方面涉及編碼微球表面報(bào)告分子的信號(hào)讀取，并經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理和分析得到待測(cè)樣本中多種組分的濃度（含量）信息。懸浮芯片的解碼方式分為流式解碼和成像解碼。
2.流式 vs 成像
流式解碼是目前最廣泛使用的解碼方式。該方式以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)，利用鞘流將編碼微球在毛細(xì)管道中進(jìn)行排列，通過(guò)逐個(gè)激發(fā)并采集高速流過(guò)的編碼微球熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)解碼。雖然流式解碼具有高準(zhǔn)確度、高通量的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在以下不足：①儀器成本高、維護(hù)難度大、運(yùn)輸要求高。流式細(xì)胞儀的儀器結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，涉及激光器、精密注射泵、光電倍增管（PMT）/雪崩二極管（APD）、復(fù)雜流體系統(tǒng)等較為精密的組件。②應(yīng)用方式不夠靈活。雖然流式解碼使用較為方便，實(shí)驗(yàn)人員只需要將編碼微球懸液置于吸樣針下方即可將樣本送入儀器自行檢測(cè)。但是流式細(xì)胞儀系統(tǒng)較為封閉，且自行定制化開發(fā)難度較大。因此無(wú)法在其他反應(yīng)平臺(tái)（如孔板、固相載體、微流控腔室等）上直接進(jìn)行解碼，限制了其應(yīng)用。
成像解碼以熒光顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)相機(jī)采集編碼微球的熒光信號(hào)并結(jié)合圖像分析進(jìn)行解碼。由于光學(xué)模塊簡(jiǎn)單，且不需要對(duì)編碼微球進(jìn)行依次排列和高速信號(hào)采集，因此儀器相對(duì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。使得成本較低、可自行維護(hù)、且易于實(shí)現(xiàn)便攜式。另外應(yīng)用場(chǎng)景也較為靈活，可以很方便地與孔板、固相載體、微流控芯片等多種平臺(tái)嫁接，拓展了懸浮芯片的應(yīng)用場(chǎng)景。以 Quanterix 公司的單分子檢測(cè)平臺(tái) SimoaTM 為例，編碼微球被逐個(gè)裝載至微流控盤片中的微孔陣列中，而后通過(guò)熒光顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并結(jié)合圖像分析完成解碼[2]。在這種情況下，必須借助成像才能完成編碼微球的解碼。
圖 1 用于懸浮芯片解碼的（A）流式系統(tǒng)和（B）熒光顯微成像系統(tǒng)示意圖[3]
3.Luminex MAGPIX?成像解碼平臺(tái)
Luminex 公司在基于流式的 Luminex 100/200TM 平臺(tái)取得成功后，于 2010 年又推出了價(jià)格更低、體積更緊湊的 MAGPIX? 平臺(tái)。同時(shí)具備了流式和成像雙重解碼平臺(tái)。成像解碼的基本要素主要包含流體模塊、光學(xué)模塊、圖像分析和數(shù)據(jù)處理軟件三個(gè)部分。下面以 MAGPIX? 平臺(tái)為例分別進(jìn)行介紹：
圖 2 Luminex 分別基于流式和成像的解碼平臺(tái)示意圖[4]
3.1 流體模塊
流體模塊主要功能是將編碼微球懸液傳送至成像區(qū)域，并完成一些清洗步驟。如圖 3A 所示，MAGPIX? 平臺(tái)的流體模塊包含進(jìn)樣針、樣本閥、樣本回路、雙向泵、微流控腔室、清洗液儲(chǔ)存容器和廢液儲(chǔ)存容器[5]。雙向泵驅(qū)動(dòng)樣本針從 96 孔板中吸取反應(yīng)完成的編碼微球懸液后通過(guò)樣本閥進(jìn)入樣本回路。而后雙向泵反向?qū)⑶逑匆簝?chǔ)存容器中的溶液吸出，推動(dòng)樣本回路中的編碼微球懸液進(jìn)入垂直放置的微流控腔室進(jìn)行成像。最后編碼微球懸液被清洗液推送進(jìn)入廢液儲(chǔ)存容器，完成一個(gè)樣本的信號(hào)采集。
圖 3B 所示的微流控腔室是流體模塊的核心，用于編碼微球的成像，因此是由石英等高透射反射比的材料制成。編碼微球懸液在進(jìn)入腔室后，會(huì)被位于腔室側(cè)壁外的磁鐵吸引，并固定在腔室內(nèi)壁。該步驟一方面保證編碼微球在成像時(shí)的靜止?fàn)顟B(tài)，另一方面保證了所有編碼微球處于同一成像焦平面。此外，流體的流速、磁鐵的磁力和位置對(duì)編碼微球的均勻分散程度也有影響。
圖 3 MAGPIX? 的（A）流體模塊、（B）微流控腔室和（C）磁場(chǎng)控制模塊示意圖[5]
3.2 光學(xué)模塊
用于成像解碼的光學(xué)模塊類似于一個(gè)熒光顯微成像系統(tǒng)。包含照明光源、物鏡、濾光片、相機(jī)。MAGPIX? 分別采用 525 nm 和 635 nm 兩束 LED 作為微球的編碼通道和報(bào)告通道的激發(fā)光源，采用 CCD 相機(jī)進(jìn)行編碼微球的成像。如圖所示，MAGPIX? 將這兩種 LED（共 6 顆，且每顆 LED 前方裝有相應(yīng)波長(zhǎng)的帶通濾光片）配置成「環(huán)」形照明空間，在微流控腔室內(nèi)形成均勻的照明場(chǎng)，對(duì)編碼微球進(jìn)行激發(fā)。微球被激發(fā)出的熒光通過(guò)一個(gè) 4 倍放大的物鏡后再經(jīng)過(guò)一個(gè)濾光片轉(zhuǎn)盤，最終被 CCD 相機(jī)采集。通過(guò) LED 的開關(guān)以及濾光片轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)動(dòng)切換，實(shí)現(xiàn)對(duì)編碼信號(hào)和報(bào)告分子信號(hào)的分別激發(fā)和采集[5]。
圖 4 MAGPIX? 光學(xué)模塊示意圖[5]
3.3 圖像分析和數(shù)據(jù)處理軟件
通過(guò)光學(xué)模塊采集到的圖像經(jīng)由圖像分析軟件進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理。主要包含以下三個(gè)步驟：①圖像前處理。主要目的是為了讓圖像從整體水平上更有利于進(jìn)一步識(shí)別和提取微球信息。采用的方法包括圖像背景扣除、濾波降噪、提高對(duì)比度、插值運(yùn)算提高分辨率等。 ②微球識(shí)別和灰度提取。主要目的是為了對(duì)圖像中的編碼微球進(jìn)行準(zhǔn)確的識(shí)別和灰度信息提取。采用的方法包括圖像偏移矯正、閾值分割、邊緣檢測(cè)、形態(tài)學(xué)處理和篩選、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。③聚類分析。主要目的是將提取到的編碼微球按照編碼通道（635 nm通道）下提取的灰度進(jìn)行分類，形成相應(yīng)的編碼微球團(tuán)簇。然后再將各團(tuán)簇微球在報(bào)告通道（525 nm通道）下提取的灰度分別輸出。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，包括均值/中值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等。圖6顯示了一部分的編碼微球聚類分析流程[6]。
圖 5 編碼微球聚類分析的部分流程示意圖[6]
4.成像解碼平臺(tái)的性能分析
前面講到，成像平臺(tái)具有性價(jià)比高、小型化、應(yīng)用更靈活等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在一些不足，主要體現(xiàn)在解碼容量和流式平臺(tái)還略有差距。主要原因有以下三點(diǎn)：①熒光顯微成像的信號(hào)采集效率相對(duì)于流式較低。流式細(xì)胞儀通過(guò)激光器的高能光束依次激發(fā)排列通過(guò)的單個(gè)編碼微球，產(chǎn)生的熒光信號(hào)被高靈敏的 PMT 或 APD 接收并直接轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，因此激發(fā)和采集效率都很高。相比之下成像解碼采用寬場(chǎng)照明方式激發(fā)視場(chǎng)面積下的多個(gè)編碼微球，熒光信號(hào)經(jīng)由物鏡和成像光路后被面陣 CMOS 或 CCD 相機(jī)采集，因此激發(fā)和采集效率相對(duì)較低。②用于成像的 CMOS 或 CCD 的動(dòng)態(tài)范圍相對(duì)較低。和流式細(xì)胞儀采用的光電探測(cè)器 PMT 的動(dòng)態(tài)范圍（最高能達(dá)到 1013：1 量級(jí)）相比，CMOS 或 CCD 的動(dòng)態(tài)范圍一般較窄（最高 105：1 量級(jí)）[7]，限制了編碼信號(hào)采集的范圍，因此解碼容量也相對(duì)較低。③成像解碼依賴于較為復(fù)雜的圖像分析算法，算法的魯棒性和穩(wěn)定性直接影響解碼的準(zhǔn)確度和靈敏度，從而影響解碼容量。還是以 MAGPIX? 為例，和基于流式解碼的平臺(tái) Luminex 200TM 相比，解碼容量從 100 重降到了 50 重。從解碼散點(diǎn)圖中可以看出，成像解碼的陣列相比流式解碼陣列去除了較低以及較高熒光的團(tuán)簇，只保留了中間的那部分團(tuán)簇，說(shuō)明成像解碼容量降低可能主要由于成像系統(tǒng)激發(fā)和信號(hào)采集效率不高、相機(jī)動(dòng)態(tài)范圍相對(duì)較窄導(dǎo)致[8]。
圖 6 Luminex 200TM 和 MAGPIX? 解碼陣列對(duì)比[8]
盡管解碼容量有所下降，但是成像平臺(tái)在實(shí)際檢測(cè)中的性能與流式平臺(tái)相當(dāng)。文獻(xiàn)報(bào)道 MAGPIX? 對(duì) oligo DNA、細(xì)胞因子、新冠中和抗體 IgG 的檢測(cè)性能均與流式平臺(tái) Luminex 100/200TM 相當(dāng)（圖7）[9,10]。此外，實(shí)際真正需要 50-plex 以上的應(yīng)用場(chǎng)景非常少。因此在絕大多數(shù)情況下，成像平臺(tái)可以替代現(xiàn)有的流式平臺(tái)。從而節(jié)約成本和實(shí)驗(yàn)室空間。更重要的是，成像平臺(tái)可以提供更多的應(yīng)用可能。除了前面提到的 Simoa 單分子檢測(cè)平臺(tái)，成像平臺(tái)可以使得懸浮芯片在更加多樣化的微流控芯片內(nèi)的應(yīng)用成為可能，包括單細(xì)胞分析[11]、多重 POCT 檢測(cè)[12]等，大幅拓寬了懸浮芯片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。
圖 7 流式平臺(tái)和成像平臺(tái)用于（A）oligo DNA 和（B）細(xì)胞因子檢測(cè)的性能對(duì)比
5.總結(jié)和展望
盡管目前流式平臺(tái)在懸浮芯片市場(chǎng)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且很多醫(yī)院、檢驗(yàn)所都已作為常規(guī)檢驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行配備，替換難度較大。但是平臺(tái)本身的特點(diǎn)使得其應(yīng)用范圍和應(yīng)用場(chǎng)景受到限制，影響了懸浮芯片進(jìn)一步發(fā)展和前進(jìn)的腳步。相比之下，成像平臺(tái)在性價(jià)比、儀器占用空間等方面具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，且保留了懸浮芯片的強(qiáng)大多重檢測(cè)能力和檢測(cè)性能。此外，成像平臺(tái)可以大幅拓展懸浮芯片的應(yīng)用范圍。我們推測(cè)，未來(lái)成像平臺(tái)將成為懸浮芯片的主流平臺(tái)，并基于此能夠更加充分地發(fā)揮懸浮芯片的優(yōu)勢(shì)，誕生出更多的新技術(shù)和新平臺(tái)。
參考文獻(xiàn)和資料
[1] Y. Wang, C. Chen, J. He, Y. Cao, X. Fang, X. Chi, J. Yi, J. Wu, Q. Guo, H. Masoomi, C. Wu, J. Ye, H. Gu, H. Xu*. Small, 2021, 17, 2100315.
[2] Rissin D M, Kan C W, Song L, et al. Multiplexed single molecule immunoassays[J]. Lab on a Chip, 2013, 13(15): 2902-2911.
[3] Optical Microscopy Application: Fluorescence. https://www.edmundoptics.com/knowledge-center/application-notes/microscopy/optical-microscopy-application-fluorescence/.
[4] Optimization of Bead Loading for MAGPIX. Luminex.
[5] Systems and Methods for Performing Measurements of One or More Materials. U.S. Patent 8296088. 2012-10-23.
[6] Methods, Storage Mediums, and Systems for Configuring Classification Regions with in a Classification Matrix of an Analysis System and for Classifying Particles of an Assay. U.S. Patent 8250021. 2012-8-21.
[7] Broadwater R. J., A Comparative Study of Photomultiplier Tubes and Charge Coupled Devices in Glow Discharge-Optical Emission Spectrometry. Master's Theses. 2003, 1422.
[8] Dunbar S. A., Li D., Introduction to Luminex xMAP Technology and Applications for Biological Analysis in China. Asia-Pacific Biotech News, 2010, 14, 10, 15-33.
[9] Equivalent Analytical Performance Between the New MAGPIX? System and the Luminex? 100/200? System. Luminex.
[10] Du J, Chu E, Zhang D, et al. A high-throughput Anti-SARS-CoV-2 IgG testing platform for COVID-19. Journal of virological methods, 2021, 287: 114009.
[11] Zhao P, Bhowmick S, Yu J, et al. Highly multiplexed single‐cell protein profiling with large‐scale convertible DNA‐antibody barcoded arrays[J]. Advanced Science, 2018, 5(9): 1800672.
[12] Chen H, Chen C, Bai S, et al. Multiplexed detection of cancer biomarkers using a microfluidic platform integrating single bead trapping and acoustic mixing techniques. Nanoscale, 2018, 10(43): 20196-20206.
本文作者
郭慶生 博士
上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院
上海羧菲生物醫(yī)藥有限公司
研究方向：新型微納材料在體外診斷中的應(yīng)用；基于微流控芯片平臺(tái)的集成式免疫分析系統(tǒng)
在微納材料合成和表面修飾、微流控芯片的開發(fā)和應(yīng)用、光學(xué)成像系統(tǒng)和圖像分析軟件領(lǐng)域具有多年研究經(jīng)驗(yàn)。相關(guān)成果發(fā)表在Small，Biosens. Bioelectron.，Chem. Commun.，ACS Appl. Mater. Interfaces等期刊，并授權(quán)多項(xiàng)專利。目前正在將快速、免洗懸浮芯片多重檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行成果轉(zhuǎn)化和產(chǎn)品化。
上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司擁有多年 IVD 微球制備及修飾工藝經(jīng)驗(yàn)，以及多項(xiàng)自主開發(fā)的核心技術(shù)。公司秉承著以納米精度支撐生命健康的使命，著眼于技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)及行業(yè)需求，為 IVD、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和改善人類健康服務(wù)。
更多相關(guān)知識(shí)與合作，歡迎關(guān)注羧菲生物公眾號(hào)